NanoDrop微量分光光度計(jì)的應(yīng)用

快速評(píng)估您的樣品中所含的核酸、蛋白質(zhì)和污染物

當(dāng)您知道樣品的含量和純度時(shí)，您便可以做出是否在下游實(shí)驗(yàn)中使用這些樣品的明智決策。Thermo Scientific NanoDrop 分光光度計(jì)系列可以幫助您快速評(píng)估樣品中是否含有適量您所需的物質(zhì)。根據(jù)您選擇的儀器，軟件還可以在存在污染物時(shí)提醒您并鑒別污染物是什么。

NanoDrop 分光光度計(jì)的核心功能是核酸和蛋白質(zhì)定量分析與純度評(píng)估，這是許多下游應(yīng)用（特別是 RT-qPCR 和質(zhì)量控制）中的步驟。另外，該儀器還支持細(xì)菌培養(yǎng)生長、動(dòng)力學(xué)等應(yīng)用以及液體聚合物 QC 等化學(xué)計(jì)量應(yīng)用

核酸定量

傳統(tǒng)上，通過測定以下三個(gè)分析波長處的紫外吸光度來定量核酸：230 nm、260 nm 和 280 nm。這些吸光度測量允許科學(xué)家測定核酸濃度并指示樣品純度。260 nm 處的最大吸光度峰的強(qiáng)度與核酸濃度成正比。

該核酸定量方法的優(yōu)勢在于操作簡單、直接，僅消耗少量樣品。然而，該方法存在的一個(gè)問題是它缺乏特異性，因?yàn)樵谶@些波長處存在吸收的任何污染物都會(huì)導(dǎo)致獲得的核酸濃度不準(zhǔn)確。

隨著紫外-可見光軟件的發(fā)展，研究人員現(xiàn)在可以在存在化學(xué)和核酸污染物的情況下選擇性地定量核酸吸光度。Thermo Scientific Acclaro 智能技術(shù)軟件（賽默飛NanoDrop One/OneC 和 NanoDrop Eight 分光光度計(jì)中的標(biāo)準(zhǔn)軟件）使用全光譜數(shù)據(jù)和高級(jí)的算法來鑒別常見的核酸污染物并提供經(jīng)過校正的核酸濃度。Acclaro 算法可以檢測 RNA 中的 dsDNA 污染以及 dsDNA 中的 RNA 污染。您還可以輸入自定義寡核苷酸序列，軟件將自動(dòng)計(jì)算應(yīng)用于核酸定量的因子。

NanoDrop One/One? 分光光度計(jì)上的預(yù)編程核酸應(yīng)用

點(diǎn)擊以從核酸主屏幕中選擇您需要的應(yīng)用。

標(biāo)記核酸的定量

熒光標(biāo)記的核酸可通過微陣列預(yù)配置軟件方法進(jìn)行定量，該方法可提供核酸濃度及標(biāo)記濃度（支持兩種染料）。該方法作為 NanoDrop One/OneC 和 NanoDrop Eight 儀器上的預(yù)配置應(yīng)用提供。

污染物鑒別

Acclaro 樣品智能技術(shù)使得 NanoDrop One/OneC 和 NanoDrop Eight 微量分光光度計(jì)能夠鑒別常見污染物并提供真實(shí)的樣品濃度，從而提供有關(guān)樣品質(zhì)量的更多信息。Acclaro 軟件納入了依賴于光譜參考庫的算法。該軟件將這些算法應(yīng)用于樣品光譜，并使用化學(xué)計(jì)量數(shù)學(xué)原理對(duì)樣品污染物進(jìn)行預(yù)測。

Acclaro 污染物鑒別

Acclaro 軟件已標(biāo)記該 dsDNA 樣品（黃色圖標(biāo)），因?yàn)樗槐椒游廴尽脑冀Y(jié)果（總 A260，藍(lán)色）中減去苯酚的吸光度貢獻(xiàn)（橙色），得到了樣品中經(jīng)過校正的真實(shí) dsDNA 濃度（綠色）。

Acclaro 參考庫目前支持檢測 dsDNA 樣品中的蛋白質(zhì)、苯酚、鹽酸胍和 RNA。另外還支持檢測 RNA 樣本中的蛋白質(zhì)、苯酚、硫氰酸胍和 dsDNA。最后，它們允許檢測蛋白質(zhì)樣品中的 DNA。未來將在參考庫中增加其他污染物。

污染物鑒別為研究人員提供了兩個(gè)方面的重要信息。首先，它可以鑒別可能存在于樣品中的特定污染物。此信息可能有助于科學(xué)家解決較難的提取或純化問題，并做出關(guān)于是否在下游實(shí)驗(yàn)中使用樣品的決策。其次，它提供了經(jīng)過校正的分析物濃度。當(dāng)建立下游反應(yīng)（例如 PCR）時(shí)，DNA 濃度是一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，經(jīng)過校正的濃度將有助于科學(xué)家確保下游實(shí)驗(yàn)的成功。

例如，基因組 DNA 制備中出現(xiàn) RNA 污染是分子生物學(xué)工作流程中的一個(gè)常見問題。使用傳統(tǒng)的分光光度法時(shí)，存在共純化的 RNA 會(huì)人為升高 DNA 濃度。通過使用全光譜數(shù)據(jù)和 Acclaro 軟件中提供的數(shù)學(xué)算法，研究人員可以鑒別 DNA 樣品中的 RNA 污染，并查看經(jīng)過校正的 DNA 濃度結(jié)果。

RT-qPCR 工作流程中的核酸定量

可靠的 RT-qPCR（定量逆轉(zhuǎn)錄 PCR）檢測需要仔細(xì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、全面的質(zhì)量控制 (QC) 以及透明的數(shù)據(jù)分析。

RT-qPCR QC 中核酸定量的重要性

核酸定量在 RT-qPCR 過程的兩個(gè)酶法步驟中都至關(guān)重要。在逆轉(zhuǎn)錄步驟中，了解（和歸一化）進(jìn)入反應(yīng)的 RNA 量將有助于大大減少 cDNA 生產(chǎn)的變異性。在 PCR 步驟中，您必須確保有足夠的 cDNA 模板來確定樣品的基因型。

將 NanoDrop 分光光度計(jì)用于 qPCR 工作流程

NanoDrop One 和 NanoDrop Eight 分光光度計(jì)非常適合定量和定性分析核酸樣品，作為下游 RT-qPCR 檢測的質(zhì)量控制步驟。這些儀器可提供準(zhǔn)確的核酸濃度并鑒別可能改變實(shí)驗(yàn)結(jié)果的污染物，有助于防止實(shí)驗(yàn)失敗或不能發(fā)表結(jié)果。

NanoDrop One 和 Eight 儀器內(nèi)置的 Acclaro 樣品智能技術(shù)可鑒別樣品中是否存在常見污染物并計(jì)算出污染物的近似濃度。核酸提取試劑盒中的常見分子可能會(huì)導(dǎo)致分析物濃度值被高估或使 qPCR 聚合酶變性。無論發(fā)生哪種情況，qPCR 實(shí)驗(yàn)都可能失敗。Acclaro 軟件可以提供經(jīng)過校正的核酸濃度且可鑒定污染物，從而較大限度地減少對(duì)失敗實(shí)驗(yàn)進(jìn)行故障排除和管理所花費(fèi)的時(shí)間。

蛋白質(zhì)定量分析

科學(xué)家可以使用 NanoDrop 儀器，通過直接或間接測量法定量分析樣品中的蛋白質(zhì)含量。NanoDrop 紫外-可見光分光光度計(jì)支持在光譜的紫外波長范圍內(nèi)使用直接 A280 和 A205 測量應(yīng)用以及在可見光譜范圍內(nèi)使用比色檢測對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行定量分析。

NanoDrop One/One? 分光光度計(jì)上的預(yù)編程蛋白質(zhì)應(yīng)用

點(diǎn)擊以從蛋白質(zhì)主屏幕中選擇您需要的應(yīng)用。

蛋白質(zhì) A280 是一個(gè)直接測量應(yīng)用程序，可直接根據(jù)樣品在280或205 nm 處的吸光度以及蛋白質(zhì)特定消光系數(shù)來計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。直接測量是一種受研究人員歡迎的選擇，因?yàn)槠洳僮骱唵危恍枰噭┗驑?biāo)準(zhǔn)品，并且只消耗極少量樣品。與核酸不同，蛋白質(zhì)顯示出相當(dāng)大的差異。蛋白質(zhì) A280 應(yīng)用適用于含有色氨酸 (Trp) 或酪氨酸 (Tyr) 殘基、半胱氨酸二硫鍵 (Cys-Cys) 并在280 nm 處顯示吸光度的純化蛋白質(zhì)。

比色檢測（如 BCA、Bradford、Lowry 和 Pierce 660 nm ）是 間接測量應(yīng)用，它們依賴生成標(biāo)準(zhǔn)曲線和產(chǎn)生可顯示與樣品中的蛋白質(zhì)量成比例的顏色變化的反應(yīng)。細(xì)胞提取物或裂解物等復(fù)雜混合物中的蛋白質(zhì)建議使用蛋白質(zhì)比色檢測進(jìn)行測量。

蛋白質(zhì)樣品評(píng)估是許多蛋白質(zhì)工作流程中的一個(gè)重要步驟。

為蛋白質(zhì)或肽樣品選擇適合的定量檢測

下列表格顯示了 NanoDrop 紫外-可見分光光度計(jì)上可用的蛋白質(zhì)定量方法的濃度范圍、描述和注意事項(xiàng)以及不同儀器上提供的各種方法。有關(guān)這些檢測的更多信息，請參閱我們的蛋白檢測選擇指南

NanoDrop 分光光度計(jì)支持的蛋白質(zhì)檢測方法

A280 可實(shí)現(xiàn)對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)和肽的快速簡單定量分析

純化蛋白質(zhì)樣品可以使用 280 nm 處的直接吸光度進(jìn)行準(zhǔn)確測量，此處的吸光度主要?dú)w因于 Trp 和 Tyr 氨基酸上的芳香鏈。蛋白質(zhì) A280（我們軟件中的一種預(yù)配置應(yīng)用）是較常用的定量方法，因?yàn)樗焖俸唵巍⒉恍枰噭┗驑?biāo)準(zhǔn)曲線，且樣品消耗量極少。

與核酸不同，每種純蛋白質(zhì)都具有基于氨基酸序列的比爾-朗伯消光系數(shù)。為了獲得準(zhǔn)確的結(jié)果，請從菜單中選擇正確的樣品類型，或手動(dòng)輸入其蛋白質(zhì)消光系數(shù)。NanoDrop One 和 NanoDrop Eight 蛋白質(zhì)編輯器功能使您能夠保存特定蛋白質(zhì)的消光系數(shù)，以便您能夠自定義您的樣品類型選項(xiàng)。

除測量濃度外，NanoDrop 分光光度計(jì)還可提供樣品中污染物的相關(guān)信息。Acclaro 樣品智能技術(shù)（包含在 NanoDrop One/OneC 和 NanoDrop Eight 儀器上）使用數(shù)學(xué)算法來檢測蛋白質(zhì)樣品中的核酸，并根據(jù)需要校正濃度結(jié)果。也可以通過測量 A260/A280 比值來評(píng)估樣品純度；比值 >1 可能表明蛋白質(zhì)樣品中存在核酸污染。

A205 是一種直接測量選擇方法，甚至適用于不含酪氨酸和色氨酸的生物分子

如果蛋白質(zhì)或肽不含 Trp 和 Tyr 殘基因此不能使用 A280 應(yīng)用進(jìn)行測量該怎么辦？由于蛋白質(zhì)的肽骨架在 190-220 nm 處吸收光，因此不含 Tyr 或 Trp 殘基的肽可以通過測量 205 nm 處的吸光度來進(jìn)行定量分析。蛋白質(zhì) A205 是 NanoDrop 軟件中的一個(gè)預(yù)配置應(yīng)用。

也可以通過選擇 Scopes 法選項(xiàng)，使用 A205 應(yīng)用對(duì)含有大量 Trp 和 Tyr 的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。事實(shí)上，A205 方法相比 A280 蛋白質(zhì)方法具有一些優(yōu)勢，比如蛋白質(zhì)間變異性較低（因?yàn)?A205 消光系數(shù)并不基于氨基酸組成）和靈敏度更高（因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在 205 nm 處具有較高的摩爾吸光系數(shù)）。盡管技術(shù)上的限制使得這些測量在過去很難進(jìn)行，但 Nanodrop 儀器的樣品保留技術(shù)和低雜散光性能簡化了通過 A205 方法定量少量蛋白質(zhì)的流程。

A205 方法存在的一個(gè)局限性是許多常用的蛋白質(zhì)緩沖液在 205 nm 處有吸光度。在使用這一技術(shù)之前，建議檢查蛋白質(zhì)緩沖液在 205 nm 處的吸光度貢獻(xiàn)。

細(xì)胞提取物或裂解物中蛋白質(zhì)的比色檢測

細(xì)胞提取物或裂解物等復(fù)雜混合物中的蛋白質(zhì)建議使用蛋白質(zhì)比色檢測進(jìn)行測量，如 Bradford、BCA、Lowry 或 Pierce 660nm 檢測。這些檢測可提供蛋白質(zhì)特異性濃度，避免了在紫外范圍內(nèi)吸光并會(huì)使 A280 增大的細(xì)胞組分的吸光度。這些應(yīng)用和其他應(yīng)用已預(yù)配置在選定的 NanoDrop 儀器上。

使用 NanoDrop One/One? 分光光度計(jì)進(jìn)行 BCA 蛋白質(zhì)檢測

BCA 檢測結(jié)果顯示總蛋白濃度（3 個(gè)紅色菱形）和標(biāo)準(zhǔn)曲線。

標(biāo)記蛋白質(zhì)的定量

標(biāo)記的抗體或其他熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)和金屬蛋白可以使用提供蛋白質(zhì)以及標(biāo)記濃度（支持 2 種染料）的蛋白質(zhì)和標(biāo)記預(yù)配置軟件應(yīng)用進(jìn)行定量。該應(yīng)用作為 NanoDrop One/OneC 和 NanoDrop Eight 分光光度計(jì)上的預(yù)配置應(yīng)用提供。

質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室

現(xiàn)在，質(zhì)量保證和質(zhì)量控制比以往任何時(shí)候都更加重要。在繁忙的 QC 實(shí)驗(yàn)室中，NanoDrop 分光光度計(jì)可使樣品濃度和純度分析變得可重現(xiàn)、常規(guī)和可靠。將下一代樣品質(zhì)量評(píng)估集成到您的工作流程中產(chǎn)生了很大影響，因?yàn)闀r(shí)間非常寶貴，所有樣品的質(zhì)量都至關(guān)重要。

mRNA 疫苗質(zhì)量控制

例如，在 mRNA 疫苗（在對(duì)抗 SARS-CoV-2 中至關(guān)重要并且越來越多地用于對(duì)抗其他病毒）的生產(chǎn)過程中，樣品濃度和純度檢查在多個(gè)步驟中都非常有用。

在測序階段，起始材料的質(zhì)量和數(shù)量都是獲得準(zhǔn)確結(jié)果的關(guān)鍵。

在質(zhì)粒生產(chǎn)中，必須檢查純化血漿是否存在基因組 DNA 和其他污染物。

在體外轉(zhuǎn)錄中，必須先檢查純化 mRNA 的純度，然后再將 mRNA 溶液灌裝到疫苗小瓶中。

細(xì)菌培養(yǎng)生長 (OD600)

可通過測量細(xì)菌培養(yǎng)物在 600 nm 處的光密度 (OD600) 來監(jiān)測細(xì)菌培養(yǎng)物的生長。盡管這是微生物學(xué)中的核心技術(shù)，但這些光學(xué)密度測量通常只能提供非常少的真實(shí)化學(xué)吸光度。相反，它們代表了由于細(xì)菌懸液散射而未進(jìn)入儀器的檢測器的光量。

您可以使用 OD600 預(yù)編程應(yīng)用在 NanoDrop OneC 和 NanoDrop Eight 分光光度計(jì)上測定 OD600。該軟件使用比爾-朗伯方程和用戶輸入的細(xì)胞數(shù)轉(zhuǎn)換系數(shù)自動(dòng)將 OD600 值轉(zhuǎn)換為每毫升細(xì)胞數(shù)。

請注意，在 NanoDrop OneC 儀器上，使用底座和比色皿選件將提供不同的 OD600 值。您可以使用轉(zhuǎn)換系數(shù)來比較基座和比色皿測量值。

基于時(shí)間的動(dòng)力學(xué)測量

在 NanoDrop OneC 儀器上，您可以對(duì)比色皿中的樣品進(jìn)行基于時(shí)間的動(dòng)力學(xué)測量。您可以190-850 nm 范圍內(nèi)的三個(gè)波長，按照用戶自定義的時(shí)間間隔（最多 5 個(gè)階段）進(jìn)行連續(xù)的吸光度監(jiān)測。比色皿測量提供擴(kuò)大的檢測下限、可選的37°C加熱器和微型攪拌器。

您可以創(chuàng)建、編輯和保存動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)作為自定義方法。

樣品動(dòng)力學(xué)結(jié)果

使用 NanoDrop OneC，按照用戶定義的時(shí)間間隔在 10 分鐘內(nèi)檢測了該比色皿樣品在 260、340 和 660 nm 處的吸光度。

NanoDrop 分光光度計(jì)的自定義方法

如上文所述，NanoDrop 分光光度計(jì)預(yù)加載了核酸定量（如 dsDNA、ssDNA 和 RNA）和蛋白質(zhì)定量（如 A280、BCA 和 Bradford）方法。您還可以在 NanoDrop One/OneC 或 NanoDrop Eight 分光光度計(jì)上創(chuàng)建自定義方法來進(jìn)行紫外-可見光測量或其他用戶定義的測量以滿足您的需求，使儀器能夠像傳統(tǒng)分光光度計(jì)一樣發(fā)揮作用。自定義方法可以監(jiān)測和報(bào)告 190-850 nm 范圍內(nèi)的多達(dá) 40 個(gè)波長，并可以直接從觸摸屏或 PC 控制軟件進(jìn)行設(shè)置。自定義方法支持將您的儀器靈活用于其他應(yīng)用。

使用預(yù)先定義的自定義方法 來分析樣品，如通過 BCA 檢測分析納米顆粒、葉綠素、血紅蛋白、葡萄糖和蛋白質(zhì)。

創(chuàng)建新的自定義方法來分析您的特殊樣品，并保存方法供日后使用。

使用自定義方法測量各種形式的血紅蛋白

例如，利用合適的消光系數(shù)和吸光度峰值，分光光度計(jì)可用來定量各種形式的血紅蛋白。

氧合血紅蛋白含有結(jié)合氧，在 414 nm、541 nm 和 576 nm 處顯示吸光度峰。

脫氧血紅蛋白不含結(jié)合氧，在 431 nm 處顯示吸光度峰。

高鐵血紅蛋白由于含有高鐵離子而不能結(jié)合氧，在 406 nm 處顯示吸光度峰。

我們?yōu)?NanoDrop One/OneC 儀器創(chuàng)建了一種自定義方法，用于測量血紅蛋白在 406、414、431、541 和 576 nm（區(qū)分氧合血紅蛋白、脫氧血紅蛋白和高鐵血紅蛋白所需的五個(gè)波長）處的吸光度。該結(jié)果圖顯示了高鐵血紅蛋白的典型吸收光譜。

高鐵血紅蛋白的典型吸收光譜

在 NanoDrop One 分光光度計(jì)上運(yùn)行血紅蛋白自定義測量方法，結(jié)果顯示在 406 nm 處有吸收峰，這是高鐵血紅蛋白的典型峰。另外，光譜未顯示氧合血紅蛋白中存在的 541 和 576 處的吸收峰。

化學(xué)計(jì)量方法

化學(xué)計(jì)量學(xué)是使用多變量數(shù)學(xué)模型和統(tǒng)計(jì)方法來同時(shí)確定很多組分的定量濃度信息。當(dāng)用于分析復(fù)雜化學(xué)樣品（混合物）的紫外-可見光數(shù)據(jù)時(shí)，化學(xué)計(jì)量學(xué)可以提供一種有效的方法來測定具有重疊光譜的化學(xué)物質(zhì)的濃度。 過去，多變量校準(zhǔn)模型的復(fù)雜性限制了其只能由擁有相關(guān)領(lǐng)域豐富知識(shí)的人使用，因此大多數(shù)數(shù)據(jù)必須傳輸給經(jīng)驗(yàn)豐富的化學(xué)計(jì)量學(xué)專家進(jìn)行收集后分析。

NanoDrop QC 軟件納入了化學(xué)計(jì)量學(xué)

Thermo Scientific NanoDrop QC 軟件為 NanoDrop OneC 微量測量平臺(tái)帶來了強(qiáng)大的化學(xué)計(jì)量分析功能。這種組合方式提供了一種具有吸引力的解決方案，適用于各種應(yīng)用，包括石化分析、藥物純度、聚合物制造、食品染料應(yīng)用以及需要化學(xué)計(jì)量分析的其他應(yīng)用。

NanoDrop QC 軟件簡化了化學(xué)計(jì)量方法的開發(fā)和部署。開發(fā)方法的科學(xué)家可以收集所選化合物的光譜并將其導(dǎo)入 Thermo Scientific TQ Analyst 軟件，用于構(gòu)建方法。然后，可以將方法直接部署到的NanoDrop OneC 紫外-可見分光光度計(jì)上，使 QC 技術(shù)人員能夠在工作場地獲得合格/不合格和其他定量結(jié)果。

使用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)液體聚合物進(jìn)行 QC

基于比色皿的紫外-可見光技術(shù)和基于 PC 的化學(xué)計(jì)量軟件是對(duì)染料、潤滑劑和粘合劑等液體進(jìn)行質(zhì)量分析的主要工具。這些溶液的樣品制備和分析可能包括多個(gè)影響高價(jià)值產(chǎn)品放行的耗時(shí)步驟。我們的創(chuàng)新型自動(dòng)調(diào)節(jié)基座紫外-可見分光光度計(jì)省去了稀釋高濃度樣品等耗時(shí)的步驟，并簡化了化學(xué)計(jì)量方法開發(fā)數(shù)據(jù)分析。

定量分析復(fù)雜混合物，即使其光譜重疊

在我們的化學(xué)計(jì)量學(xué)應(yīng)用資料中，我們演示了逐步創(chuàng)建并驗(yàn)證用于確定復(fù)雜混合物中單種偶氮染料的濃度的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法。我們展示了如何使用 NanoDrop QC 軟件來獲取包含多種具有高度重疊紫外-可見光光譜的組分的樣品的定量信息。

純檸檬黃和日落黃的全紫外-可見光譜 (200-700 nm)

使用 NanoDrop QC 軟件的紫外-可見光模塊采集光譜，并在 800 nm 處進(jìn)行基線校正。制備每種染料的 10 mg/mL 和 2 µL 等分溶液，并在儀器上測量。